(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210891446.2 (22)申请日 2022.07.27 (71)申请人 江苏医药职业学院 地址 224008 江苏省盐城市解 放南路283号 (72)发明人 葛安兴　王雪莲　 (74)专利代理 机构 北京思创大成知识产权代理 有限公司 1 1614 专利代理师 高爽 (51)Int.Cl. A61K 47/46(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/0784(2010.01) (54)发明名称 朗格汉斯细胞源外泌体作为经皮免疫抗原 递呈载体的应用 (57)摘要 本发明属于免疫 领域， 涉及朗格汉斯细胞源 外泌体作为经皮免疫抗原递呈载体的应用。 所述 朗格汉斯细胞源外泌体增强T细胞免疫反应。 本 发明以在皮肤和黏膜发挥抗原递呈作用的Lexo 作为研究对象， 首次确认Lexo能够作为经皮免疫 疫苗抗原递呈的载体， 研究结果将为深入阐释通 过经皮免疫或皮内注射接种疫苗的作用机制及 开发新型HPV相关皮肤黏膜肿瘤的非细胞治疗疫 苗打下坚实基础。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115463220 A 2022.12.13 CN 115463220 A 1.朗格汉斯细胞源外泌体作为经皮免疫抗原递呈载体的应用， 所述朗格汉斯细胞源外 泌体增强T细胞免疫反应。 2.根据权利要求1所述的应用， 其中， 所述朗格汉斯细胞源外泌体由包括以下步骤的方 法制得： (1)向含有人外周血单个核细 胞的预冷缓冲液中加入CD14+磁珠， 混合均匀， 4℃避光孵 育， 孵育后加入预冷缓冲液， 混匀细胞， 离心弃 上清； (2)向步骤(1)离心产物中加入预冷缓冲液重悬， 混成单细胞悬液， 将单细胞悬液加入 CD14细胞磁珠分选系统， 分离 CD14+细胞； (3)CD14+细胞用完全RPMI ‑1640培养基重悬， 调整细胞数后加入细胞因子rhGM ‑CSF、 rhIL‑4和TGF‑β 培养， 得到所述朗格汉斯细胞源外泌体。 3.根据权利要求2所述的应用， 其中， 步骤(1)中孵 育的时间为10 ‑20min。 4.根据权利要求2所述的应用， 其中， 步骤(1)中离心的条件为在200 ‑400g离心8 ‑ 12min。 5.根据权利要求2所述的应用， 其中， 步骤(3)中， 细胞因子rhGM ‑CSF的浓度为800 ‑ 1200IU/mL、 rhI L‑4的浓度为80 0‑1200IU/mL， TGF ‑β 的浓度为8 ‑12ng/mL。 6.根据权利要求5所述的应用， 其中， 在培 养第三天补加相同浓度细胞因子 。 7.根据权利要求2所述的应用， 其中， 步骤(3)中， 培养至第七天进行收集， 得到所述朗 格汉斯细胞源外泌体。 8.根据权利 要求2所述的应用， 其中， 所述人外周血单个核细胞通过Ficoll淋巴细胞分 离液分离得到 。 9.根据权利要求1 ‑8中任意一项所述的应用， 其中， 所述朗格汉斯细胞源外泌体的直径 为30‑200nm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115463220 A 2朗格汉斯细胞源外泌体作 为经皮免疫抗原递呈载体的应用 技术领域 [0001]本发明属于免疫领域， 具体地， 涉及朗格汉斯细胞源外泌体作为经皮免疫抗原递 呈载体的应用。 背景技术 [0002]经皮免疫作为一种新的疫苗接种途径， 是将抗原和佐剂应用于局部皮肤， 诱导机 体产生免疫反应的新方法。 与其他的免疫途径相比， 经皮免疫具有安全性高、 患者依从性 好、 免疫效果好等优点， 更重要的是经皮 免疫可诱导产生黏膜免疫反应， 这对于通过皮肤黏 膜途径引起的细菌病毒感染的预防和治疗尤其重要， 如人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的宫 颈癌等。 [0003]皮肤作为人体重要的免疫器官， 存在多种免疫细胞， 这些细胞不仅具有非特异性 免疫防御功能， 而且参与机体特异性免疫反应中的抗原识别、 递呈、 免疫细胞激活等过程。 皮肤表皮层内的朗格汉斯细胞(LCs)作为一种专门的抗原递呈细胞(APCs)， 能诱导机体产 生特异性的T细胞免疫反应， 在人体的防御系统中起着至关重要的作用。 研究证实， 处于非 淋巴组织中未发育成熟的LC s摄取、 加工处理抗原后， 在表皮中的角质形成细胞和真皮中的 肥大细胞产生的细胞因子诱导下， LC s向局部引流淋巴结迁移。 在迁移过程中， LC s逐渐发育 成熟， 高表达抗原递呈分子及CD80、 CD86等共刺激分子， 并迁移至淋巴结T细胞区， 提供T细 胞活化的第一、 二活化信号， 促使初始T细胞活化， 并分化 为效应性T细胞和记 忆性T细胞。 [0004]外泌体是由包括抗原递呈细胞、 肠上皮细胞、 T淋巴细胞、 B淋巴细胞、 神经细胞及 肿瘤细胞等在内多种细胞分泌的纳米级囊泡小体， 为脂质双层膜包围的扁平球体， 呈杯 状， 直径约为30 ‑200nm。 其重要特性是可携带来源细胞的多种功能蛋白， 介导细胞间的物质和 信息交流， 因此被称为细胞间信使。 研 究证实， 树突细胞(DCs)分泌的外泌体(Dexo)几乎含 有DCs表达的所有抗原递呈相关分子， 如主要组织相容性复合体(MHC) ‑I类和II类分子， CD1a、 b、 c和d以及CD80、 CD86等共刺激分子。 所以Dexo可作为DCs提呈抗原肽的一种途径， 不 需大量细胞迁移， 将抗原从外周组织有效传递到淋巴组织， 刺激初始T细胞活化及增殖， 尤 其是激发CD8+的细胞毒性T细胞(CTL)反应。 同时， Dexo介导MHC ‑I或II特异性抗原肽复合物 在DCs间或DCs与其他APC之间传递， 这样传递的结果可使携带MHC抗原肽复合物的APC数量 增加， 进而扩大免疫应答效果。 并且外泌体在 免疫反应中具有毒性低、 无免疫原性、 渗透性 好、 靶向性高、 稳定性 好、 安全性高等优点。 [0005]近年的研究结果显示， DCs来源的外泌体(Dexo)携带DCs许多重要的参与抗原提呈 的分子， 如MHC ‑I和II类分子、 热休克蛋白HSP70、 HSP9 0、 四次跨膜蛋白(CD9、 CD81、 CD63)、 黏 附分子以及 共刺激分子等， 并具有诱导抗原特异 性的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应的潜能。 Zitvogel等在1998年首次报道了应用负载肿瘤抗原的Dexo成功地清除荷瘤 小鼠的肿瘤。 这 一结果极大地激起了众多肿瘤免疫学工作者对外泌体研究 的热情。 外泌体极有可能被开 发 成为高效的能够诱 导抗原特异性 抗肿瘤免疫效应的新型的非细胞治疗性疫苗。说　明　书 1/5 页 3 CN 115463220 A 3